FastKing gDNA аз байн бурдани RT SuperMix

A-1 RNA вайрон мешавад

—— РНК -и баландсифатро бе ифлосшавӣ пок кунед. Маводе, ки аз он РНК истихроҷ мешавад, бояд то ҳадди имкон тару тоза бошад, то таназзули РНК пешгирӣ карда шавад. Пеш аз аксуламали RT тамомияти РНК -ро дар гели денатуратсия таҳлил кунед. Пас аз истихроҷи РНК, он бояд дар 100% формамид нигоҳ дошта шавад. Агар ингибитори RNase истифода шавад, ҳарорати гармкунӣ бояд <45 ° C бошад ва рН бояд аз 8.0 камтар бошад, вагарна ингибитор ҳама RNase -и басташударо озод мекунад. Ғайр аз он, ингибитор RNase бояд дар маҳлули дорои ≥ 0,8 мм DTT илова карда шавад.

A-2 RNA дорои ингибиторҳои реаксияҳои транскрипсияи баръакс мебошад

—— Ингибиторҳои баръакси транскрипсия SDS, EDTA, глицерол, пирофосфати натрий, спермидин, формамид, намаки гуанидин ва ғайраҳоро дар бар мегиранд. РНК -и назоратиро бо намуна омехта кунед ва ҳосилро бо аксуламали назоратии РНК муқоиса кунед, ки оё ингибитор мавҷуд аст. Боридани боришоти РНК бо 70% (v/v) этанол барои нест кардани ингибиторҳо.

A-3 Пошидани нокифояи праймерҳо, ки барои синтез кардани риштаи аввали cDNA истифода мешаванд

—— Муайян кунед, ки ҳарорати пошидан барои праймерҳои дар таҷриба истифодашаванда мувофиқ аст. Барои гексамерҳои тасодуфӣ тавсия дода мешавад, ки пеш аз расидан ба ҳарорати реаксия ҳароратро дар 25 ° C барои 10 дақиқа нигоҳ доред. Барои праймерҳои махсуси генӣ (GSP), дигар GSP-ро санҷед ё ба олиго (dT) ё гексамери тасодуфӣ гузаред.

A-4 Миқдори ками оғози RNA

—- Миқдори РНК -ро зиёд кунед. Барои намунаҳои РНК камтар аз 50 нг, 0.1 мкг то 0.5 мкг ацетил BSA -ро дар синтези аввалаи cDNA истифода бурдан мумкин аст

A-5 Пайдарпаии ҳадаф дар бофтаҳои таҳлилшуда ифода карда намешавад.

——Бо дигар бофтаҳо кӯшиш кунед.

Реаксияи ПТР-6 ноком мешавад

—- Барои ду марҳилаи RT-PCR, қолаби cDNA дар қадами ПТР наметавонад аз 1/5 ҳаҷми реаксия зиёд бошад.

A-1 Пошидани ғайри мушаххаси праймерҳо ва қолабҳо

——Дар охири 3'-и праймерҳо набояд 2-3 dG ё dC дошта бошанд. Дар синтези якум ба ҷои праймерҳои тасодуфӣ ё олиго (dT) праймерҳои ба Ген хос хосро истифода баред. Дар якчанд давраҳои аввал ҳарорати баландтар ва сипас ҳарорати пасттарро истифода баред. Барои беҳтар кардани хусусияти реаксия полимеразаи Taq DNA полимеразаи гармро истифода баред.

A-2 Тарҳи пасти праймерҳои ба ген хос хос

—— Ҳамин принсипҳоро барои тарҳрезии праймер такмил диҳед.

A-3 RNA бо ДНК-и геномӣ олуда шудааст

—- Бо РНК бо DNase дараҷаи ПТР муолиҷа кунед. Барои ошкор кардани ифлосшавии ДНК аксуламали назоратиро бе транскрипсияи баръакс насб кунед.

A-4 Ташаккули димери праймер

—— Праймерҳои тарҳрезӣ бе пайдарпайии иловагӣ дар охири 3 '.

A-5 Хеле баланд Mg²⁺ тамаркуз

—— Оптимизатсияи Mg²⁺ консентратсия барои ҳар як шаблон ва комбинатсияи праймер

А-6 бо ДНК-и хориҷӣ олуда шудааст

—— Маслиҳатҳо ва ферментҳои ба аэрозол тобоварро истифода баред.

А-1 Мундариҷаи маҳсулоти аввалаи ришта хеле баланд аст

- - Дар марҳилаи реаксияи анъанавии ПТР ҳаҷми маҳсулоти аввалаи риштаро кам кунед.

А-2 Миқдори хеле баланд дар реаксияи ПТР

—— Воридоти ибтидоиро кам кунед.

A-3 Давраҳои аз ҳад зиёд

- Шароити вокуниши ПТР -ро оптимизатсия кунед ва шумораи давраҳои ПТР -ро кам кунед.

A-4 Ҳарорати хеле пасти пӯстшавӣ

—— Баланд бардоштани ҳарорати пошхӯрӣ барои пешгирӣ кардани оғоз ва тамдиди мушаххас.

A-5 Тақвияти махсуси фрагментҳои олигонуклеотид, ки дар натиҷаи таназзули ДНазаи ДНК ба вуҷуд омадаанд-РНК-и баландсифатро барои пешгирии олудашавии ДНК хориҷ кунед.

RT-PCR бояд баръакси транскрипсияи РНК ба cDNA бошад ва сипас cDNA-и баръакси транскриптсияшударо ҳамчун шаблон барои аксуламали ПТР барои тақвият додани порчаи ҳадаф истифода барад. Мувофиқи шароити мушаххаси таҷриба ё праймерҳои тасодуфӣ, Oligo dT ва праймерҳои мушаххаси гениро интихоб кунед. Ҳама праймерҳои дар боло зикршударо барои мРНК -и ҳуҷайраҳои кӯтоҳи эукариотӣ бе сохтори муйчинак истифода бурдан мумкин аст.

Праймерҳои тасодуфӣ: Барои РНК-и дароз бо сохтори мӯй, инчунин ҳама намудҳои РНК, аз қабили rRNA, mRNA, tRNA ва ғайра мувофиқанд. Онҳо асосан барои аксуламали RT-PCR як қолаби ягона истифода мешаванд.

Oligo dT: Барои RNA бо думи думдор PolyA мувофиқ аст (РНК прокариотӣ, эукариотӣ Oligo dT rRNA ва tRNA думҳои PolyA надоранд). Азбаски Oligo dT ба думи PolyA пайваст аст, сифати намунаҳои РНК бояд баланд бошад ва ҳатто миқдори ками таназзул миқдори синтези дарозмуддати cDNA-ро хеле коҳиш медиҳад.

Праймерҳои хоси ген: Илова ба пайдарпаии шаблонҳо, ки барои ҳолатҳое мувофиқанд, ки пайдарпаии ҳадаф маълум аст.

Ду роҳ вуҷуд дорад:

1. Усули истинодҳои дохилӣ: Дар назария, cDNA қисмҳои ДНК -и дарозии гуногун аст, аз ин рӯ натиҷаи электрофорез доғ аст. Агар фаровонии РНК кам бошад, ҳеҷ гуна маҳсулот дар электрофорез нишон намедиҳад, аммо ин маънои онро надорад, ки ягон маҳсулот бо ПТР зиёд карда нашавад. Умуман, барои муайян кардани cDNA истинодҳои дохилиро истифода бурдан мумкин аст. Агар истинодҳои дохилӣ натиҷа дошта бошанд, сифати cDNA -ро асосан кафолат додан мумкин аст (дар баъзе ҳолатҳо, агар порчаи генҳои мақсаднок хеле дароз бошад, истисноҳо вуҷуд доранд).

2. Агар як гене маълум бошад, ки бо ин шаблон тақвият дода шуда бошад, онро бо праймерҳои ин ген тасдиқ кардан мумкин аст. Тақвияти истинодҳои дохилӣ маънои онро надорад, ки бо cDNA мушкиле вуҷуд надорад. Азбаски истинодҳои дохилӣ дар cDNA фаровонӣ доранд, тақвият додан осон аст. Агар cDNA бо сабабҳои гуногун қисман таназзул ёбад, аз нуқтаи назари эҳтимолият, натиҷаҳои ПТР -и генҳои фаровонии паст ба таври назаррас таъсир хоҳанд расонд. Дар ҳоле ки истинодҳои дохилӣ ҳоло ҳам фаровон аст, эҳтимол ба тақвият таъсир нахоҳад расонд.

Қисман таназзули РНК. Ягонагӣ ва тозакунии РНК -ро муайян кунед

Мундариҷаи РНК -и намудҳои гуногун метавонад гуногун бошад, аммо дар маҷмӯъ, РНК -и умумии истихроҷшуда бояд ду бандҳои возеҳи 28S ва 18S -ро дар электрофорези гел дошта бошад ва дурахши банди қаблӣ бояд нисбат ба дуввумӣ баландтар бошад. Банди 5S нишон медиҳад, ки РНК хароб шудааст ва равшаниаш ба дараҷаи таназзул мутаносиб аст. Тақвияти бомуваффақияти истинодҳои дохилӣ маънои онро надорад, ки ягон мушкилот бо РНК вуҷуд надорад, зеро истинодоти дохилӣ фаровон аст, РНК -ро то он даме, ки таназзул шадид набошад, метавон тақвият дод. OD₂₆₀/ОД₂₈₀таносуби РНК -и холис, ки бо спектрофотометр чен карда мешавад, бояд аз 1.9 то 2.1 бошад. Миқдори ками ифлосшавии сафеда дар РНК таносубро коҳиш медиҳад. То он даме, ки арзиши хеле паст набошад, ба ҶТ таъсир намерасонад. Чизи аз ҳама муҳим барои RT ин беайбии РНК мебошад.

Густариши генҳои истинодҳои дохилӣ танҳо метавонад нишон диҳад, ки RT муваффақ шудааст, аммо он ҳатман ба сифати риштаи cDNA алоқаманд нест. Азбаски порчаҳои истинодҳои дохилӣ одатан аз ҷиҳати ҳаҷм хурд ва ифодаи баланд мебошанд, муваффақ шудан дар транскрипсияи баръакс осонтар аст. Аммо, андоза ва ифодаи генҳои мақсаднок аз як ген ба ген фарқ мекунад. Сифати cDNA -ро танҳо бо истинодҳои дохилӣ арзёбӣ кардан мумкин нест, хусусан барои фрагментҳои мақсадноки аз 2 кб зиёд.

Баъзе намунаҳо сохторҳои мураккаби дуввум доранд ё дорои мазмуни бойи GC мебошанд ё бо фаровонии камарзиш қиматбаҳоянд. Дар ин ҳолатҳо, мувофиқи андозаи фрагменти ҳадаф ва намуна бояд транскриптазаи баръакси мувофиқ интихоб карда шавад. Барои шаблонҳои РНК бо мазмуни баланди GC ва сохтори мураккаби дуввум, кушодани сохтори дуввум дар ҳарорати паст ё бо транскриптазаи баръакси мушкул душвор аст. Барои ин шаблонҳо, Quant Reverse Transcriptase-ро интихоб кардан мумкин аст, зеро иҷрои транскрипсияи баръакси он бешубҳа аз транскриптазаи баръакси силсилаи M-MLV беҳтар аст, ки метавонад қолабҳои гуногуни РНК-ро самаранок баргардонад ва РНК-ро ба дараҷаи аввал ба cDNA нависад. Ҳангоми истифодаи маҷмӯаи умумии транскриптазаи баръакс, системаи 20 мкл метавонад танҳо 1 мкг умумии РНК -ро самаранок баргардонад. Лутфан ба иқтидори максималии ҶТ диққат диҳед. Агар шаблон аз ҳад зиёд илова карда шавад, транскрипсияи баръакс ба РНК бо фаровонии зиёд бартарӣ медиҳад. Аз ин рӯ, беҳтар аст, ки аз ҳадди ниҳоии система зиёд набошем.

A-1 Муайян кунед, ки оё РНК ба таври ҷиддӣ хароб мешавад ва агар RT муваффақ бошад

Умуман, сабаби нокомии тақвияти истинодҳои дохилӣ аксар вақт аз таназзули ҷиддии РНК ба вуҷуд меояд. Сабаби дигари эҳтимолӣ нокомии транскрипт аст. Истинодоти дохилӣ наметавонад ҳамчун стандарт барои доварӣ кардани сифати як риштаи cDNA истифода шавад, аммо он метавонад ҳамчун стандарт барои доварӣ кардани муваффақияти транскрипсияи баръакс истифода шавад, агар ягон мушкилоти сифати РНК вуҷуд надошта бошад. Муҳимтар аз ҳама дар раванди транскрипсияи баръакс нигоҳ доштани ҳарорати доимӣ ва системаи реаксияи доимӣ бо мақсади баланд бардоштани самаранокии реаксияҳо мебошад.

A-2 Муайян кунед, ки оё праймерҳо барои васеъ кардани генҳои истинодҳои дохилӣ боэътимоданд ё агар бо реагентҳое, ки дар ПТР истифода мешаванд, ягон мушкилот вуҷуд дорад.

Барои миқдории нисбӣ, RNA бояд пеш аз транскрипсияи баръакс миқдор карда шавад, ки он дар бисёр маҷмӯаҳои транскрипсияи баръакс низ лозим аст, масалан, вуруди РНК -ро ҳамчун 1 мкг муайян кунед. Азбаски cDNA -и баръакси транзитӣ як ҳалли омехта, аз ҷумла РНК, олиго dT, фермент, dNTP ва ҳатто пасмондаи каме ДНК мебошад, инҳироф ба амал меояд, аз ин рӯ дақиқ муайян кардани cDNA ғайриимкон аст. Аз ин рӯ, миқдории RNA зарур аст. Бо назардошти самаранокии баръакси транскрипсия дар байни намунаҳои гуногун, миқдори cDNA -и гирифташуда бояд якхела бошад ва таҳлили миқдорӣ метавонад муқоисаи сатҳҳои ифодаи генҳои гуногунро дар ҳамон миқдори умумии РНК нишон диҳад. Ҳангоми иҷрои ПТР -и миқдории флуоресценти нисбӣ, пас аз транскрипсияи баръакс cDNA -и миқдорӣ талаб карда намешавад, зеро генҳои истинодҳои дохилиро метавон ҳамчун истинод иҷро кард.

Он асосан ба генҳо марбут аст ва транскрипсияи баръакси порчаи дароз барои аксари генҳо ғайриимкон аст. Аввалан, самаранокии транскрипсияи баръакс нисбат ба ПТР хеле пасттар аст. Сониян, минтақаи бойи GC ва сохтори дуввуми бисёр генҳо ҳам транскрипсияи баръакс ва ҳам ПТР -ро маҳдуд мекунанд. Ниҳоят, самаранокии садоқатмандӣ ва тақвияти ПТР дар як вақт кафолат додан душвор аст. Дар раванди транскрипсияи баръакс, ҳеҷ кас кафолат дода наметавонад, ки барои генҳои нусхаи кам порчаи дароз гирад, хусусан бо истифода аз oligo dT. Дар мавриди 5 'UTR бо GC бештар, он боз ҳам душвортар аст. Аз ин рӯ, ҳоло ҳам усули оқилона барои баргардонидани транскрипт бо праймерҳои тасодуфӣ, пайдо кардани ҷойҳои ҷудоии табиӣ дар порчаи ҳадаф, тақвият додани сегментҳо ва сипас ҳазмкунии маҳдудкунӣ ва лигатсия мебошад. Умуман, мустақиман тақвият додани порчаҳои аз 2 кб калон душвор аст, аммо ба даст овардан на ҳама вақт имконнопазир аст: 1. Пеш аз ҳама, кафолати беайбии РНК/мРНК ва истихроҷи ТРИЗОЛ афзалият дорад. 2. Маҷмӯи M-MLV RT-PCR метавонад бевосита истифода шавад. Вақти пошиданро дароз кунед ва рақами давраро дар раванди тақвият дуруст афзоиш диҳед. Ба таври дигар, ПТР -и дохилшударо метавон истифода бурд, ё аввал як ё ду аксуламалро бо денатуратсия ва тамдиди мувофиқи дароз пеш аз тақвияти муқаррарии ПТР гузаронад, ки метавонад барои васеъ кардани порчаҳо кумак кунад. Ба дурустии полимераза диққат диҳед. 3. Long Taq метавонад дар ПТР барои ба даст овардани натиҷаҳои беҳтарин истифода шавад. 4. Барои истифодаи ифодаи сафеда, полимеразаи боэътимод бояд татбиқ карда шавад.

Ду намуди транскриптазаи баръакси пешниҳодкардаи TIANGEN вуҷуд дорад: Quant/King RTase ва TIANScript M-MLV. Фарқи асосии байни онҳо миқдори вуруди шаблонҳост. Quant як транскриптазаи баръакси нодир аст, ки аз M-MLV-и маъмул истифодашаванда, ки аз вируси лейкемияи мурини Молони гирифта шудааст, фарқ мекунад. Квант як транскриптазаи нави самараноки баръакси рекомбинантӣ мебошад, ки аз ҷониби муҳандисии Escherichia coli ифода ёфтааст. Quant барои тақвият додани 50 нг-2 мкг РНК бо фаъолияти транскрипсияи баръакси баланд ва ҳосили баланд мувофиқ аст. Дар муқоиса бо MMLV ё AMV -и муқаррарӣ, бузургтарин хусусияти Quant дар он аст, ки он бо шаблонҳои РНК робитаи хеле қавӣ дорад ва метавонад шаблонҳои мураккаби транскриптиро бе денатуратсияи ҳарорати баланд баргардонад. Барои қолабҳо бо мундариҷаи GC баландтар, самаранокии баръакс баландтар аст. Аммо, ин транскриптазаи баръакс дорои фаъолияти RNase H мебошад, ки метавонад ба дарозии маҳсулоти cDNA таъсир расонад (барои шаблонҳои <4.5 кб мувофиқ). Барои транскрипсияи баръакси баръакс, TIANScript MMLV баръакс тавсия дода мешавад. Ин RTase як ферментҳои тағирёфта бо фаъолияти хеле заифи RNase H мебошад, ки барои синтези дарозмуддати (> 5 кб) cDNA мувофиқ аст.

Транскрипсияи як қадами баръакс ва амплифатсияи ПТР дар ҳамон қубур бидуни кушодани сарпӯши қубур байни синтези cDNA ва амплификатсия анҷом дода мешавад, ки барои паст кардани ифлосшавӣ муфид аст. Азбаски ҳама намунаҳои cDNA -и гирифташуда барои тақвият истифода мешаванд, ҳассосият баландтар аст ва ҳадди аққал 0,01 pg умумии RNA. Барои бомуваффақият гузаронидани RTPCR, праймерҳои махсуси генӣ одатан барои оғози синтези cDNA истифода мешаванд. Усули ду зина, яъне транскрипсияи баръакс ва тақвияти ПТР дар ду марҳила сурат мегирад. Аввалан транскрипсияи баръакс аз қолаби РНК барои ба даст овардани cDNA гузаронида мешавад ва cDNA -и гирифташуда ба як ё якчанд реаксияҳои гуногуни ПТР дучор мешавад. Усули ду зина метавонад олиго (dT) ё праймерҳои тасодуфиро барои роҳнамоии синтези занҷири аввали cDNA истифода барад ва метавонад ҳама маълумоти mRNA-ро аз як намунаи мушаххас баргардонад.