Адаптери ягонаи индекси TIANSeq (Illumina)

Дар айни замон, технологияи пайдарпайии баландсуръат асосан ба технологияи пайдарпайии насли оянда асос ёфтааст. Азбаски дарозии хониши технологияи пайдарпайии насли оянда маҳдуд аст, мо бояд пайдарпаии пурраи дарозиро ба китобхонаҳои хурди порчаҳо тақсим кунем. Мувофиқи эҳтиёҷоти таҷрибаҳои гуногуни пайдарпайӣ, мо одатан пайдарпайии якпаҳлӯ ё пайдарпайии дукарата интихоб мекунем. Айни замон пораҳои ДНК-и китобхонаи пайдарпайии насли оянда одатан дар ҳудуди 200-800 bp тақсим карда мешаванд.

а) ДНК сифати паст дорад ва дорои ингибиторҳо мебошад. Барои пешгирии пешгирии фаъолияти ферментҳо намунаҳои баландсифати ДНК-ро истифода баред.

б) Ҳангоми истифодаи усули бидуни ПТР барои сохтани китобхонаи ДНК миқдори намунаи ДНК нокифоя аст. Вақте ки вуруди ДНК-и пора-пора аз 50 нг зиёд аст, ҷараёни кории бидуни ПТР метавонад дар ҷараёни сохтмони китобхона интихобан сурат гирад. Агар шумораи нусхаҳои китобхона хеле кам бошад, то мустақиман пайдарпай карда нашавад, пас аз пайвастшавии адаптер китобхонаи ДНК -ро тавассути ПТР зиёд кардан мумкин аст.

в) ифлосшавии РНК ба дақиқ набудани миқдории ибтидоии ДНК оварда мерасонад Дар ҷараёни тозакунии ДНК -и геномӣ ифлосшавии РНК вуҷуд дошта метавонад, ки метавонад ба миқдори носаҳеҳи ДНК ва боркунии нокифояи ДНК ҳангоми сохтмони китобхона оварда расонад. RNA метавонад бо табобат бо RNase хориҷ карда шавад.

А-1

а) Қисмҳои хурд (60 bp-120 bp) пайдо мешаванд Фрагментҳои хурд одатан пораҳои адаптер ё димерҳое мебошанд, ки аз ҷониби адаптерҳо сохта шудаанд. Тозакунӣ бо донаҳои магнитии Agencourt AMPure XP метавонад ин пораҳои адаптерро самаранок тоза кунад ва сифати пайдарпайиро таъмин кунад.

б) Пас аз тақвияти ПТР дар китобхона пораҳои калон пайдо мешаванд Ҳаҷми порчаи ДНК -и китобхона пас аз пайваст кардани адаптер 120 bp зиёд мешавад. Агар порчаи ДНК пас аз пайвастшавии адаптер зиёда аз 120 bp афзоиш ёбад, он метавонад аз амплифатсияи фрагментҳои ғайримуқаррарии тақвияти аз ҳад зиёди ПТР бошад. Кам кардани шумораи давраҳои ПТР метавонад вазъиятро пешгирӣ кунад.

в) Андозаи ғайримуқаррарии фрагментҳои ДНК -и китобхона пас аз пайвасткунии адаптер Дарозии адаптер дар ин маҷмӯа 60 б.п. Вақте ки ду нӯги фрагмент ба адаптерҳо пайваст карда мешаванд, дарозӣ танҳо 120 bp зиёд мешавад. Ҳангоми истифодаи адаптере, ки ғайр аз ин маҷмӯа пешбинӣ шудааст, лутфан бо провайдер тамос гиред, то маълумоти мувофиқро ба монанди дарозии адаптер пешниҳод кунед. Лутфан боварӣ ҳосил кунед, ки ҷараёни кор ва амалияи таҷрибаҳо қадамҳои дар дастур зикршударо иҷро мекунанд.

г) Андозаи ғайримуқаррарии фрагментҳои ДНК пеш аз пайвасткунии адаптер Сабаби ин мушкилот метавонад аз шароити нодурусти реаксия ҳангоми парокандагии ДНК ба вуҷуд ояд. Барои вуруди гуногуни ДНК бояд вақти гуногуни реаксия истифода шавад. Агар вуруди ДНК зиёда аз 10 нг бошад, мо тавсия медиҳем, ки вақти реаксияи 12 дақро ҳамчун вақти оғоз барои оптимизатсия интихоб кунем ва андозаи порчаи дар ин вақт истеҳсолшуда асосан дар ҳудуди 300-500 bp аст. Истифодабарандагон метавонанд мувофиқи талаботи худ дарозии пораҳои ДНК-ро дар тӯли 2-4 дақиқа афзоиш ё кам кунанд, то порчаҳои ДНК-ро бо андозаи лозимӣ оптимизатсия кунанд.

А-2

а) Вақти тақсимшавӣ оптимизатсия карда нашудааст, агар ДНК -и пора -пора хеле хурд ё хеле калон бошад, лутфан ба Дастурамал оид ба интихоби вақти тақсимшавӣ, ки дар дастур барои муайян кардани вақти реаксия оварда шудааст, муроҷиат кунед ва ин нуқтаи вақтро ҳамчун назорат истифода баред. системаи реаксия барои дароз кардан ё кӯтоҳ кардани 3 дақиқа барои дурусттар танзим кардани вақти тақсимшавӣ.

А-3

Тақсимоти ғайримуқаррарии андозаи ДНК пас аз табобати фрагментатсия

а) Усули нодурусти обшавии реагенти фрагментатсионӣ ё реагент пас аз обшавӣ пурра омехта нашудааст. Реагенти 5 × Fragmentation Enzyme Mix -ро дар ях об кунед. Пас аз об шудан, реагентро ба таври баробар омехта карда, поёни қубурро оҳиста лағжонед. Реагентро гирдоб надиҳед!

б) Намунаи вуруди ДНК дорои EDTA ё дигар моддаҳои ифлоскунанда мебошад. Пусидани ионҳои намак ва агентҳои хелатат дар марҳилаи тозакунии ДНК махсусан барои муваффақияти таҷриба муҳим аст. Агар ДНК дар 1 × TE гудохта шавад, барои иҷрои фрагментатсия усулеро, ки дар дастур нишон дода шудааст, истифода баред. Агар консентратсияи EDTA дар маҳлул номуайян бошад, тавсия дода мешавад, ки ДНК -ро тоза кунед ва онро дар оби деионизатсияшуда барои вокуниши минбаъда пароканда кунед.

в) Микдори дақиқи ибтидоии ДНК Андозаи ДНК -и пароканда бо миқдори воридшавии ДНК зич алоқаманд аст. Пеш аз табобати фрагментатсия, миқдори дақиқи ДНК бо истифодаи Qubit, Picogreen ва усулҳои дигар барои муайян кардани миқдори дақиқи ДНК дар системаи реаксия муҳим аст.

 г) Омодасозии системаи реаксия ба дастур мувофиқат намекунад Омодасозии системаи парокандашудаи реаксия бояд дар рӯи ях қатъиян мувофиқи дастурҳо гузаронида шавад. Барои таъмини самараи беҳтарин, ҳама ҷузъҳои реаксия бояд дар болои ях гузошта шаванд ва омодасозии системаи реаксия пас аз хунуккунии пурра анҷом дода шавад. Пас аз анҷом ёфтани омодагӣ, лутфан ламс кунед ё пипетка кунед, то бодиққат омехта кунед. Гиря накунед!

1. Усули нодурусти омехта (гирдбод, ларзишҳои шадид ва ғайра) боиси паҳншавии ғайримуқаррарии пораҳои китобхона мегардад (тавре ки дар расми зерин нишон дода шудааст) ва ба ин васила ба сифати китобхона таъсир мерасонад. Аз ин рӯ, ҳангоми омода кардани маҳлули реаксияи Fragmentation Mix, лутфан бо пипетка ба боло ва поён омехта кунед ё бо ангушт ангушт занед ва баробар омехта кунед. Эҳтиёт бошед, ки бо гирдоб омехта нашавед.

2. Барои сохтани китобхона бояд ДНК -и тозашуда истифода шавад

■ Беайбии хуби ДНК: Банди электрофорез зиёда аз 30 кб аст, бидуни думболи

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. Миқдори вуруди ДНК бояд дақиқ бошад Тавсия дода мешавад, ки барои чен кардани ДНК усулҳои Qubit ва PicoGreen истифода шаванд, на Nanodrop.

4. Мундариҷаи EDTA дар маҳлули ДНК бояд муайян карда шавад EDTA ба реаксияи парокандагӣ таъсири калон мерасонад. Агар мундариҷаи EDTA баланд бошад, пеш аз санҷиши минбаъда тозакунии ДНК лозим аст.

5. Маҳлули реаксияи фрагментатсионӣ бояд дар ях омода карда шавад Раванди тақсимшавӣ ба ҳарорат ва вақти реаксия ҳассос аст (хусусан пас аз илова кардани тақвиятдиҳанда). Барои таъмини дурустии вақти реаксия, лутфан системаи реаксияро дар болои ях омода кунед.

6. Вақти вокуниши фрагментатсия бояд дақиқ бошад Вақти реаксияи қадами тақсимшавӣ бевосита ба андозаи маҳсулоти порча таъсир мерасонад ва ҳамин тариқ ба тақсимоти андозаи пораҳои ДНК дар китобхона таъсир мерасонад.

1. Кадом намуди намуна ба ин маҷмӯа мувофиқ аст?

Намуди татбиқшавандаи ин маҷмӯа метавонад RNA -и пурра ё mRNA -и тозашуда бо беайбии хуби РНК бошад. Агар барои сохтани китобхона RNA -и куллӣ истифода шавад, тавсия дода мешавад, ки аввал маҷмӯаи камшавии rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391) барои нест кардани rRNA истифода шавад.

2. Оё намунаҳои FFPE -ро барои сохтани китобхона бо ин маҷмӯа истифода бурдан мумкин аст?

MRNA дар намунаҳои FFPE то андозае бо беайбии нисбии камбизоат таназзул хоҳад ёфт. Ҳангоми истифодаи ин маҷмӯа барои сохтмони китобхона тавсия дода мешавад, ки вақти тақсимшавӣ оптимизатсия карда шавад (вақти парокандагӣ кӯтоҳ карда шавад ё қисмбандӣ карда нашавад).

3. Бо истифода аз қадами интихоби андоза, ки дар дастури маҳсулот оварда шудааст, чӣ метавонад боиси сегменти воридшударо каҷравии ночиз кунад?

Интихоби андоза бояд мутобиқи қадами интихоби андоза дар ин дастури маҳсулот анҷом дода шавад. Агар инҳироф вуҷуд дошта бошад, сабаб метавонад дар он бошад, ки маҳтобҳои магнитӣ ба ҳарорати хонагӣ мувозинат надоранд ё пурра омехта нашудаанд, пипетка дақиқ нест ё моеъ дар нӯг мемонад. Тавсия дода мешавад, ки барои таҷриба маслиҳатҳо бо адсорбсияи паст истифода шаванд.

4. Интихоби адаптерҳо дар сохтмони китобхона

Дар маҷмӯаи сохтмони китобхона реагенти адаптер мавҷуд нест ва тавсия дода мешавад, ки ин маҷмӯа дар якҷоягӣ бо TIANSeq адаптерҳои индекси ягона (Illumina) (4992641/4992642/4992378) истифода шавад.

5. Сифати иттилоотии китобхона

Муайянкунии миқдории китобхона: Qubit ва qPCR барои муайян кардани консентратсияи омма ва консентратсияи молярии китобхона истифода мешаванд. Амалиёт ба таври қатъӣ мувофиқи дастури маҳсулот аст. Консентратсияи китобхона умуман ба талаботи пайдарпаии NGS ҷавобгӯ хоҳад буд. Муайян кардани доираи тақсимоти китобхона: Бо истифода аз Agilent 2100 Bioanalyzer барои муайян кардани доираи тақсимоти китобхона.

6. Интихоби рақами сикли тақвият

Мувофиқи дастурҳо, шумораи давраҳои ПТР 6-12 аст ва шумораи давраҳои зарурии ПТР бояд мувофиқи вуруди намуна интихоб карда шавад. Дар китобхонаҳои ҳосили баланд, аз ҳад зиёд тақвият одатан дар дараҷаҳои гуногун ба амал меояд, ки он бо қуллаи каме калонтар пас аз қуллаи диапазони ҳадаф ҳангоми кашфи Agilent 2100 Bioanalyzer зоҳир мешавад ё консентратсияи ошкоршудаи Qubit нисбат ба qPCR камтар аст. Аз ҳад зиёд афзоиш як падидаи муқаррарист, ки ба пайдарпаии китобхона ва таҳлили минбаъдаи маълумот таъсир намерасонад.

7. Хӯшаҳо дар профили муайянкунии Agilent 2100 Bioanalyzer пайдо мешаванд

Пайдоиши хӯшаҳо дар муайянкунии Agilent 2100 Bioanalyzer аз сабаби тақсимоти нобаробарии намунаҳо мебошад, ки дар онҳо миқдори муайяни пораҳо зиёдтар хоҳад буд ва ин пас аз ғанигардонии ПТР возеҳтар хоҳад шуд. Дар ин ҳолат, тавсия дода мешавад, ки интихоби андоза иҷро нашавад, яъне ҳолати тақсимшавиро ба 94 ° C барои 15 дақиқа инкубатсия кунед, ки дар он тақсимоти порча хурд ва мутамарказ аст ва якхелагиро беҳтар кардан мумкин аст.