2 × омехтаи Pfu PCR

Шаблон A-1

■ Шаблон дорои омехтаҳои сафеда ё ингибиторҳои Taq ва ғайра мебошад. - Шаблон ДНК -ро тоза кунед, наҷосати сафедаҳоро хориҷ кунед ё ДНК -и шаблонро бо маҷмӯаҳои тозакунӣ истихроҷ кунед.

■ Денатуратсияи шаблон пурра нест - —Мувофиқ ҳарорати денатуратсияро зиёд кунед ва вақти денатуратсияро дароз кунед.

■ Таназзули шаблон ——Шаблонаро аз нав омода кунед.

Праймер А-2

■ Сифати пасти праймерҳо --— Праймерро аз нав синтез кунед.

■ Таназзули праймерҳо - - Примерҳои консентратсияи баландро барои нигоҳдорӣ ба ҳаҷми хурд ҷудо кунед. Аз яхкунӣ ва обшавии сершумор ё криоконсерви дарозмуддати 4 ° C пешгирӣ кунед.

■ Тарҳи нодурусти праймерҳо (масалан, дарозии праймер кофӣ нест, димер байни праймерҳо ва ғайра ба вуҷуд омадааст) -Праймерҳои навро тарҳрезӣ кунед (аз ташаккули димер ва сохтори дуввум канорагирӣ кунед)

A-3 мг²⁺тамаркуз

■ Мг²⁺ консентратсия хеле паст аст - - Ба таври мунтазам зиёд кардани Mg²⁺ консентратсия: оптимизатсияи Mg²⁺ консентратсия бо як қатор реаксияҳо аз 1 мм то 3 мм бо фосилаи 0,5 мм барои муайян кардани оптималии Mg²⁺ консентратсия барои ҳар як шаблон ва праймер.

A-4 Ҳарорати гармкунӣ

■ Ҳарорати баланди гармкунӣ ба бастани праймер ва шаблон таъсир мерасонад. ——Ҳарорати пӯстро паст кунед ва вазъро бо градиенти 2 ° C оптимизатсия кунед.

Мӯҳлати тамдиди A-5

■ Мӯҳлати тамдиди кӯтоҳ —— Мӯҳлати тамдидро зиёд кунед.

Ҳодисаҳо: Намунаҳои манфӣ инчунин гурӯҳҳои пайдарпайии мақсаднокро нишон медиҳанд.

A-1 олудашавии ПТР

■ Ифлосшавии байниҳамдигарии пайдарпаии мақсаднок ё маҳсулоти тақвиятдиҳанда - - Эҳтиёт накунед, ки намунаи дорои пайдарпаии мақсаднокро дар намунаи манфӣ пошед ё аз қубури центрифуга рехт. Реагентҳо ё таҷҳизот бояд барои нест кардани кислотаҳои мавҷудаи нуклеинӣ автоклав карда шаванд ва мавҷудияти олудашавӣ тавассути таҷрибаҳои манфии назорат муайян карда шавад.

■ Ифлосшавии реагентҳо - Реагентҳоро ҷобаҷо кунед ва дар ҳарорати паст нигоҳ доред.

A-2 Сарвазириr

■ Мг²⁺ консентратсия хеле паст аст - - Ба таври мунтазам зиёд кардани Mg²⁺ консентратсия: оптимизатсияи Mg²⁺ консентратсия бо як қатор реаксияҳо аз 1 мм то 3 мм бо фосилаи 0,5 мм барои муайян кардани оптималии Mg²⁺ консентратсия барои ҳар як шаблон ва праймер.

■ Тарҳи нодурусти праймер ва пайдарпаии ҳадаф дорои гомология бо пайдарпаии ғайри ҳадафӣ мебошад. —— Праймерҳои дубора тарҳрезишуда.

Ҳодисаҳо: Бандҳои тақвияти ПТР бо андозаи пешбинишуда номувофиқанд, ё калон ё хурд, ё баъзан ҳарду бандҳои махсуси тақвиятдиҳанда ва бандҳои тақвиятдиҳандаи ғайрихусусӣ ба амал меоянд.

Праймер А-1

■ Хусусияти заифи ибтидоӣ

—— Праймерро аз нав сохтан.

■ Консентратсияи праймер хеле баланд аст.

А-2 мг²⁺ тамаркуз

■ Мг²⁺ консентратсия хеле баланд аст - - Консентратсияи Mg2+ -ро дуруст кам кунед: Mg -ро оптимизатсия кунед²⁺ консентратсия бо як қатор реаксияҳо аз 1 мм то 3 мм бо фосилаи 0,5 мм барои муайян кардани оптималии Mg²⁺ консентратсия барои ҳар як шаблон ва праймер.

А-3 полимеразаи термостабил

■ Миқдори аз ҳад зиёди фермент - Миқдори ферментро дар фосилаи 0,5 U кам кунед.

A-4 Ҳарорати гармкунӣ

■ Ҳарорати пӯст хеле паст аст--Ҳарорати пӯстро ба таври мувофиқ баланд бардоред ё усули думарҳилавии пухтупазро қабул кунед

Давраҳои PCR A-5

■ Аз ҳад зиёд давраҳои ПТР - Шумораи давраҳои ПТР -ро кам кунед.

Праймер А-1—— Хусусияти заиф ——Аз нав тарҳрезии праймер, тағир додани мавқеъ ва дарозии праймер барои баланд бардоштани хусусияти он; ё анҷом додани ПТР -и лона.

Шаблон A-2 ДНК

—— Шаблон пок нест - Шаблонро тоза кунед ё ДНК -ро бо маҷмӯаҳои тозакунӣ истихроҷ кунед.

A-3 мг²⁺ тамаркуз

—-Мг²⁺ консентратсия хеле баланд аст - - Mg -ро дуруст кам кунед²⁺ консентратсия: оптимизатсияи Mg²⁺ консентратсия бо як қатор реаксияҳо аз 1 мм то 3 мм бо фосилаи 0,5 мм барои муайян кардани оптималии Mg²⁺ консентратсия барои ҳар як шаблон ва праймер.

A-4 dNTP

—- Консентратсияи dNTPs хеле баланд аст - Консентратсияи dNTP -ро ба таври мувофиқ кам кунед

A-5 Ҳарорати гармкунӣ

——Харорати пухта хеле паст — —Харорати пухтанро ба таври бояду шояд баланд бардоред

Давраҳои A-6

——Дар бисёр давраҳо —Рақами давраро оптимизатсия кунед

Қадами аввал интихоби полимеразаи мувофиқ аст. Полимеразаи муқаррарии Taq бинобар набудани фаъолияти экзонуклеазаи 3'-5 'таҳрир карда наметавонад ва номувофиқатӣ самаранокии паҳншавии порчаҳоро хеле коҳиш медиҳад. Аз ин рӯ, полимеразаи муқаррарии Taq наметавонад фрагментҳои мақсадноки аз 5 кб калонро самаранок тақвият диҳад. Так полимеразаи дорои тағироти махсус ё дигар полимеразаи боэътимод бояд барои беҳтар кардани самаранокии васеъшавӣ ва қонеъ кардани ниёзҳои тақвияти фрагментҳои дароз интихоб карда шавад. Илова бар ин, тақвияти порчаҳои дароз инчунин тасҳеҳи мувофиқи тарҳи праймер, вақти денатуратсия, вақти тамдид, pH буферӣ ва ғайраҳоро талаб мекунад. Бо мақсади пешгирии вайроншавии шаблон, вақти денатуратсия дар 94 ° C бояд то 30 сония ё камтар дар як давра кам карда шавад ва вақти баландшавии ҳарорат то 94 ° C пеш аз тақвият бояд камтар аз 1 дақиқа бошад. Ғайр аз он, муқаррар кардани ҳарорати васеъкунӣ дар тақрибан 68 ° C ва тарҳрезии вақти тамдид аз рӯи суръати 1 кб/дақиқа метавонад тақвияти муассири пораҳои дарозро таъмин кунад.

Сатҳи хатогии тақвияти ПТР метавонад бо истифода аз полимеразаҳои гуногуни ДНК бо садоқати баланд кам карда шавад. Дар байни ҳама полимеразаҳои Taq DNA, ки то имрӯз пайдо шудаанд, ферменти Pfu дорои сатҳи пасттарин хато ва садоқати баландтарин аст (ба ҷадвали замимашуда нигаред). Илова ба интихоби фермент, муҳаққиқон метавонанд суръати мутацияи ПТР -ро тавассути оптимизатсияи шароити реаксия, аз ҷумла оптимизатсияи таркиби буферӣ, консентратсияи полимеразаи термостабилизатсия ва оптимизатсияи рақами сикли ПТР боз ҳам коҳиш диҳанд.